人源化突触前蛋白A53T突变转基因帕金森症小鼠模型

α-synuclein基因是一种突触前蛋白基因，其编码的蛋白主要存在于突触前神经末梢的细胞浆内，是形成路易小体和路易神经突的主要成分。至今，α-synuclein的功能仍不十分清楚，在生理条件下认为它可调节突触血管的再生和塑性。研究人员发现α-synuclein的错义突变导致编码蛋白的53位由丙氨酸变为苏氨酸（A53T），之后还发现了A30P和E46K的突变，这几种突变均可导致蛋白质二级结构β折叠的形成，通过对转突变基因小鼠的研究发现，这种蛋白折叠，可使可溶性的蛋白容易自我聚集，促进纤维丝形成，最终导致神经细胞变性，并形成帕金森（PD）特征性的路易小体和路易突触。

参考文献：

1、α-synuclein转基因小鼠帕金森病模型的建立。

2、Caught in act：alpha-synuclein isthe culprit in Parkinson’s disease.

3、 Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movementdisorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein.

4、β-syn WT在α-syn A53T帕金森病鼠模型中的研究。

5、3月龄α-突触核蛋白A53T转基因小鼠认知功能的改变。

6、中脑过表达突变型A53T α-synuclein增加血脑屏障通透性的研究。

7、转突变型A53T α-突触核蛋白基因的帕金森模型小鼠中脑的全基因组甲基化测序分析。

背景小鼠：C57BL/6J

构建信息：

体外构建人源化α-synuclein含A53T突变的cDNA插入到质粒中：

转基因小鼠通过PCR方法进行鉴定，鼠尾DNA采用酚氯仿方法提取，PCR的20ul反应体系中包括10XPCRbuffer2ul，MgCl2 1ul，10mmol/L dNTP0.4ul，上下游引物50umol/L个0.2ul，模板DNA 1ul，Taq聚合酶0.2ul，ddH2O补至20ul。反应条件为：94℃预变性3min，循环参数94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s，30个循环后72℃延伸10min，目的条带大小为323bp。

12月龄时用免疫组化分析会发现广泛分布的α-synuclein复合物，并在脊髓、脑干和小脑发现沉积。α-synuclein出现沉积的时间与小鼠运动功能出现障碍的时间相吻合。轴突和髓鞘出现进行性的超微结构变性，神经元出现的沉积主要成分是10-16nm的α-synuclein，其出现的部位、时间与人类帕金森症的情况类似。

行为学实验中采用平衡木实验、步距实验、十字迷宫实验、悬尾实验和游泳实验：

通过Western blot方法对α-synuclein、凋亡相关蛋白、自噬相关的暗白、线粒体自噬相关蛋白的表达情况进行了检测，另外还通过蛋白免疫印迹方法检测了A53T小鼠脑内凋亡蛋白、自噬蛋白的表达情况。

A53T转基因小鼠行为学检测中，与同龄野生鼠相比，从8月龄开始体重开始增长缓慢；步距测试中，A53T转基因鼠步距减少，步伐不稳；平衡木结果显示，年老的转基因鼠通过平衡木所用的时间比正常鼠多；从体重、步距、平衡木实验来看，A53T小鼠的身体状况比正常鼠差，运动能力低于正常鼠；强迫游泳和悬尾实验表明A53T小鼠静止时间显著高于正常鼠，说明A53T鼠求生欲低于正常鼠，伴有一定抑郁倾向；高架十字迷宫测试中，A53T转基因小鼠在开壁中停留时间低于正常鼠，说明A53T鼠比正常鼠容易恐惧，对周边环境的探索心理降低。

帕金森主要病理特征是中枢神经系统内α-synuclein的聚集和沉积，其基因多态性与PD关系密切，所以α-synuclein蛋白的变化是研究PD基础，WB检测α-synuclein在A53T小鼠脑内表达情况，结果如下：

从WB结果灰度值统计分析来看，与正常鼠比较，A53T转基因小鼠的α-synuclein表达量显著增多。

对A53T小鼠脑内凋亡相关蛋白进行了WB和蛋白免疫印迹分析：

结果显示，A53T小鼠脑中LC3II/LC3I比值比正常鼠高，自噬相关ATG5表达量显著高于正常鼠，ATG4D、p62蛋白表达高于正常鼠。免疫荧光标记LC3在荧光显微镜下可观察到A53T鼠脑黑质脑区内有明亮点状物，说明A53T突变诱导细胞自噬的发生。

对A53T脑内线粒体自噬相关蛋白进行了WB检测：

结果显示，A53T鼠脑内线粒体自噬相关蛋白Parkin、PINK1以及Beclin1的含量都高于正常鼠，表明A53T转基因鼠通过PINK1/Parkin通路介导线粒体自噬的发生。

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

该品系是研究帕金森症的模型动物。